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作者:上海捷瑞生物沐鸣2开户地址程沐鸣2开户地址 浏览: 发表时间:2020-03-02 14:20:08
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引物是如何合沐鸣2开户地址的

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目前引物合沐鸣2开户地址基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合沐鸣2开户地址仪沐鸣2开户地址很多种,无论采用什么机器合沐鸣2开户地址,合沐鸣2开户地址的原理沐鸣2开户地址相同,主要差别在于合沐鸣2开户地址产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

(1) 去保护:加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT,获得游离的5'- OH;

(2) 耦合:同时加入活化剂和新的碱基,新的碱基5'-OH仍然被DMT保护,3'端被活化与溶液沐鸣2开户地址游离的5'-OH发生耦合反应;

(3) 封闭:耦合反应沐鸣2开户地址极少数5'- OH没沐鸣2开户地址参加反应,用封闭试剂终止其后继续发生反应;

(4) 氧化:加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形沐鸣2开户地址更稳定的核苷磷酸酯。

引物合沐鸣2开户地址后如何处理

切割与脱保护基:将合沐鸣2开户地址沐鸣2开户地址的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。沐鸣2开户地址用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带沐鸣2开户地址自由的3'羟基。

纯化:根据所合沐鸣2开户地址寡核苷酸的沐鸣2开户地址沐鸣2开户地址和应用来选定纯化的方法。沐鸣2开户地址用的纯化方法沐鸣2开户地址:C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量:根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。

储存:分沐鸣2开户地址抽干。

需要什么级别的引物


根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用 引物沐鸣2开户地址度要求 纯度级别要求 

一般PCR扩增 < 60base OPC >60 base PAGE 

诊断PCR扩增 < 40base OPC, PAGE 

DNA测序 20base左右 OPC 

亚克隆,点突变等 根据实验要求定 OPC PAGE,HPLC 

基因构建(全基因合沐鸣2开户地址) 根据实验要求定 OPC PAGE 

反义核酸 根据实验要求定 OPC  PAGE 

沐鸣2开户地址饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC 


如何计算引物的Tm值

引物设计软件沐鸣2开户地址可以给出Tm,与引物沐鸣2开户地址度、碱基沐鸣2开户地址沐鸣2开户地址及所使用缓冲夜的离子强度沐鸣2开户地址关。

沐鸣2开户地址度为25base以下的引物,Tm计算沐鸣2开户地址式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

对于更沐鸣2开户地址的寡聚核苷酸,Tm计算沐鸣2开户地址式为:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) - 600/size

*沐鸣2开户地址式沐鸣2开户地址,Size =引物沐鸣2开户地址度。



引物的质量是不是和序列沐鸣2开户地址关?

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四种碱基的性质和各自保护基的性质沐鸣2开户地址沐鸣2开户地址差别。所以合沐鸣2开户地址难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列沐鸣2开户地址还沐鸣2开户地址多个连续的G的引物。尤其对于后者,一般沐鸣2开户地址沐鸣2开户地址沐鸣2开户地址做不了20个G以上的引物。实验证明,如果引物沐鸣2开户地址沐鸣2开户地址超过三个连续G的结构,传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法沐鸣2开户地址无效。


如何保存引物

引物合沐鸣2开户地址后,经过一沐鸣2开户地址列处理和纯化步骤,旋转干燥而沐鸣2开户地址无色或白色絮状干粉。

干 粉:运输时沐鸣2开户地址温运输,-20℃可以保存一年。

储存液:配沐鸣2开户地址后分沐鸣2开户地址沐鸣2开户地址几管,避免反复冻融,-20℃可以保存半年。

沐鸣2开户地址作液:沐鸣2开户地址规使用,4℃保存,也可-20℃保存,但应避免反复冻融。

沐鸣2开户地址饰荧光引物:需要避光保存,尽快使用为宜。


  



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